嗜热芽孢杆菌

耐酸耐热菌（库克）的检测方法1 适用范围本方法适用于清汁、浊汁、水和浓缩果汁中的耐酸耐热菌的检测2 仪器和试剂2.1 恒温水院80±1℃2.2 恒温培养箱：40±1℃2.3 灭菌培养皿：直径为90mm2.4 灭菌试管：18×180mm2.5 滤膜：0.45um水系一次性滤膜2.6 酵母粉 2.7 蛋白胨2.8 琼脂粉 2.9 葡萄糖 2.10 吐温802.11 12.5%苹果酸2.12 灭菌蒸馏水2.13 K氏培养基平板：在1000ml的三角瓶中放入500ml蒸馏水加入1.25g酵母粉、2.50g蛋白胨、6.50g琼脂粉、0.5g 葡萄糖和0.5ml吐温80使其溶解轻轻盖上三角瓶的盖子在121℃灭菌25分钟；

在一个小烧杯中加入10ml蒸馏水和1.25克的苹果酸搅拌直至溶解将苹果酸的水溶液用0.45um的滤膜过滤将处理过的苹果酸水溶液加入到灭菌的K氏培养基中搅拌均匀使其pH值达到3.7±0.1当冷却到大约50℃时将K氏培养基倾注到培养皿中凝固后在0-5℃的冰箱中储存有效期60天并记录配制日期3 操作步骤3.1 样品处理3.1.1 浓缩清汁：打开水浴锅调整温度到80±1℃以无菌操作取10ml浓缩清汁于15ml灭菌的试管中再移取10ml浓缩清汁于另一带有温度计的15mL的试管中作为温度控制用盖上样品试管的盖子将上述样品试管和温度控制试管放在水浴锅中当温度达到80±1℃开始计时维持13分钟（用计时器计时）冷却至室温用90-100ml的灭菌蒸馏水将热处理过的样品转入灭菌容器中摇匀将稀释后的样品溶液用0.45um的滤膜真空过滤3.1.2 清汁、水：打开水浴锅调整温度到80±1℃以无菌操作取150ml清汁（或水）于已灭过菌的玻璃样品瓶中再移取150ml清汁（或水）于另一带有温度计的玻璃样品瓶中作为温度控制用盖上样品瓶的盖子将上述样品试管和温度控制试管放在水浴锅中当温度达到80±1℃开始计时维持13分钟（用计时器计时）将热处理过的样品冷却至室温用0.45um的滤膜真空过滤3.1.3 浊汁：打开水浴锅调整温度到80±1℃以无菌操作取20ml浊汁于已灭过菌的试管中再移取20ml浊汁于另一带有温度计的20mL的试管中作为温度控制用盖上样品试管的盖子将上述样品试管和温度控制试管放在水浴锅中当温度达到80±1℃时开始计时维持13分钟（用计时器计时）冷却至室温将热处理的样品用0.45um的滤膜真空过滤3.2 培养及计数取掉过滤器的上部装置用灭菌的镊子将过滤膜从过滤器上取下放在K氏培养基上轻敲数次以保证滤膜与培养基接触倒置于40-41℃恒温培养箱中在恒温培养箱底部放置一个有水的盘子以调整恒温培养箱的湿度培养5天培养结束后记录该培养温度下滤膜上的菌落数根据对样品的污染情况可选择稀释度用灭菌吸管吸取25ml样品加入到225ml灭菌蒸馏水中做成1：10的稀释度；

用灭菌吸管吸取1：10的稀释液25ml加入到225ml灭菌蒸馏水中做成1：100的稀释度稀释后的样品的检测方法同上培养结束后记录滤膜上的菌落数并按相应的稀释度进行计算4 数据处理结果报告10ml的浓缩清汁样品中含有的菌落数报告单位为cfu/10ml结果报告150ml的清汁（或水）样品中含有的菌落数报告单位为cfu/150ml结果报告20ml的浊汁样品中含有的菌落数报告单位为cfu/20ml